В 1961 году в журнале Nature появилась блестящая статья одного из открывателей структуры ДНК Френсиса Крика, в которой он, основываясь на очень скудных фактических данных, сумел, тем не менее, расшифровать генетический код. Ровно через 50 лет после выхода этой замечательной работы в другом престижном журнале - Science - появилась публикация, авторы которой предложили удобный и эффективный способ изменять этот код.
Все живые организмы планеты Земля "собирают" сами себя, руководствуясь инструкциями, записанными в их ДНК. Молекулы ДНК представляют собой линейные полимеры, составленные из четырех типов "букв" (по химической структуре это нуклеотиды) - А, Т, Г и Ц. Определенные сочетания троек этих "букв" кодируют те или иные аминокислоты - элементарные "кирпичики", из которых состоят белки. Такие тройки нуклеотидов были названы кодонами, и всего их насчитывается 64 штуки.
При этом большинство живых существ используют только 21 аминокислоту, так что почти на каждую элементарную составляющую белка приходится несколько кодонов. Кроме того, три кодона не кодируют аминокислот, а отвечают за "знаки препинания", понятные считывающим генетический код ферментам. Пунктуация генетического кода ограничивается точками - натыкаясь на соответствующие кодоны (их называют стоп-кодонами), ферменты прекращают синтезировать цепь аминокислот, и готовый белок высвобождается. Большинство организмов используют три типа точек - ТАГ, ТАА и ТГА.
Функционально эти стоп-кодоны не отличаются друг от друга, но за их распознавание отвечают различные ферменты. Например, у кишечной палочки Escherichia coli фермент RF1 считывает инструкции прекратить синтез белка, закодированные в кодонах ТАА и ТАГ, а фермент RF2 - инструкции, записанные в кодонах ТАА и ТГА.
Как и в любом другом языке, знаков препинания в генетическом коде меньше, чем собственно букв. Соответственно, изменить значение какого-либо стоп-кодона проще, чем значение любой другой тройки нуклеотидов. Авторы новой работы решили заменить в ДНК E. coli стоп-кодоны ТАГ на стоп-кодоны ТАА - таким образом, все "точки" при считывании белка будут распознаваться одним, ставшим универсальным ферментом - RF2.
ТАГ - самый редкий стоп-кодон в геноме E. coli, и он встречается там 314 раз. Процесс замены "точек", разработанный Фарреном Исааксом (Farren Isaacs) из Гарвардской медицинской школы, Питером Кэрром (Peter Carr) из Массачусетского технологического института и их коллегами, состоял из нескольких этапов. На первой стадии ученые искусственно синтезировали 314 коротких фрагментов ДНК E. coli, в норме содержащие последовательность ТАГ - однако в новосинтезированных фрагментах ТАГ были заменены на ТАА.
На следующем этапе работы специалисты "загоняли" эти кусочки ДНК в геном бактерий. Для этого ученые "пробивали" мембрану бактериальных клеток при помощи разрядов тока (это стандартная молекулярно-биологическая техника), и синтезированные ими фрагменты протискивались в образовавшуюся брешь и встраивались в геном. Технологию синтеза и встройки нужных последовательностей в геном бактерий авторы работы в Science создали ранее и назвали ее MAGE (Multiplex automated genome engineering - автоматизированное повторяющееся изменение генома).
В итоге ученые получили 33 линии E. coli, в каждой из которых 10 каких-либо ТАГ-кодонов были заменены на ТАА. Для того чтобы получить линию бактерий, у которой все стоп-кодоны ТАГ были бы заменены на аналоги, исследователи разработали технику под названием CAGE (conjugative assembly genome engineering - изменение генома путем конъюгативной сборки).
Ключевым словом в непонятном названии техники является слово "конъюгация" - этим термином биологи обозначают процесс обмена генетическим материалом у бактерий. У этих живых существ нет полового процесса, аналогичного половому процессу, например, у животных - бактериальные клетки просто делятся надвое, предварительно создав копию собственной ДНК. Однако иногда бактерии обмениваются друг с другом фрагментами своей ДНК - для этого клетки соединяются вместе, и одна из них передает соседке несколько генов.
Авторы добились того, чтобы бактерии передавали друг другу именно те фрагменты ДНК, в которых ТАГ-кодоны "исправлены" на ТАА. Так как ученые знали, какие именно стоп-кодоны заменены на аналоги в каждой из 32 линий, полученных по итогам MAGE, они смогли организовать обмен между линиями так, чтобы конъюгирующая клетка получала от партнера именно те фрагменты ДНК, которые у нее самой все еще содержат неизмененный кодон ТАГ. В результате каждого цикла CAGE количество замен ТАГ на ТАА в каждой клетке удваивалось. В конце концов ученые получили четыре линии E. coli, в каждой из которых около четверти всех ТАГ-кодонов были заменены на ТАА.
На следующих стадиях "скрещивания" из этих четырех линий можно будет получить одну, в геноме которой не будет ни одного кодона ТАГ (пока ученые этого не сделали). Если удалить из ДНК таких бактерий гены, отвечающие за распознавание стоп-кодона ТАГ, то эту тройку нуклеотидов можно превратить в код для какой-нибудь искусственно созданной аминокислоты. Вставка генов, которые кодируют ферменты, распознающие и синтезирующие эту аминокислоту, является рутинной операцией, тем более, что ранее в других лабораториях уже проводились подобные работы.
Создание организмов с измененным генетическим кодом является не только занимательной "загадкой для ума", которую любопытно решить. Бактерии, использующие нестандартные сочетания нуклеотидов для кодирования тех или иных аминокислот (или "точек" при синтезе), будут устойчивы к вирусам, которые используют для размножения генетический аппарат бактерий. Вирус, инфицировавший такую искусственно измененную клетку, не сможет синтезировать новые вирусные частицы, так как белоксинтезирующий аппарат зараженной бактерии будет включать в вирусные белки неправильные аминокислоты.
Кроме того, используя технику CAGE, биологи смогут создавать организмы, синтезирующие аминокислоты, которые не встречаются в природе. Теоретически, это позволит создавать белки с новыми свойствами - хотя до сих пор ученым не удалось превзойти природу по способности конструировать эффективно и точно работающие машины из аминокислот.
Одно из основных преимуществ технологии CAGE - это ее дешевизна. Сами авторы сравнивают созданный ими алгоритм внесения большого количества изменений в геном живых существ с весьма затратной работой одиозного исследователя Крейга Вентера, который в 2010 году представил созданный сотрудниками его института организм с полностью искусственным геномом. Хотя многие специалисты сомневаются в практической ценности изысканий Вентера.
Впрочем, до массового использования технологии CAGE, например, в фармакологии, еще далеко. Заменить стоп-кодоны оказалось сравнительно легко, но удастся ли исследователям так же эффективно менять тройки нуклеотидов, кодирующие собственно аминокислоты - пока неясно. Но в любом случае созданная авторами техника массовой замены генетического материала окажется полезной ученым для проведения самых разнообразных молекулярно-биологических исследований.