Двойная спираль ДНК является одним из символов науки, но немногие знают, что эта нуклеиновая кислота способна образовывать и более сложные структуры. До недавнего времени они интересовали разве что химиков и кристаллографов — считалось, что неканонические формы ДНК не встречаются в живых клетках. Британские биологи нанесли мощный удар по этому стереотипу.
Про Джеймса Уотсона, одного из первооткрывателей двойной спирали ДНК, рассказывают такой анекдот. Как-то на лабораторном семинаре в Колд Спринг Харбор, когда колкий на язык Уотсон больше обычного увлекся критикой своих сотрудников, один из них попытался урезонить своего начальника: «Джим, если у тебя есть Нобелевская премия (a Nobel prize), это еще не значит, что все остальные ничего не понимают в том, чем занимаются». Ответ Уотсона оказался труднопереводимым, но запоминающимся: «I don't have a Nobel Prize, I have the Nobel prize» («у меня не просто Нобелевская премия, а та самая Нобелевская премия»), — заявил он.
Уотсона можно понять: опубликованная им совместно с Френсисом Криком двуспиральная структура ДНК — это не только важнейшее открытие в биологии XX века, это еще и хрестоматийный образ, один из главных символов науки вообще. Вероятно, именно из-за феноменальной известности этой структуры мало кто знает, что ДНК бывает не только двуспиральной. Да и не всякая двуспиральная ДНК одинакова.
Вручение Нобелевской премии первооткрывателям структуры ДНК. На переднем плане Френсис Крик и король Швеции Густаф Адольф. За награждением наблюдают Макс Перутц, Джон Кендрю, Морис Уилкинс и Джеймс Уотсон.. Фото: AP, архив
Другая двойная
Открытие Уотсона и Крика (на основе данных, полученных Розалинд Франклин) на долгое время затмило все остальные структуры, которые рассматривались в качестве альтернативных. Это неудивительно: ключевое свойство модели заключается в том, что она самой своей структурой показывает, как может храниться и копироваться генетическая информация.
После публикации Уотсона и Крика сразу стало понятно, что для воспроизводства нуклеиновой кислоты достаточно расплести две ее нити и для каждой из них, как по слепку, восстановить комплементарную пару. Это сразу объясняло и механизмы наследственности, и причину изменчивости, да и вообще саму теорию эволюции ставило на прочную экспериментальную почву.
A, B и Z-формы ДНК. Видно, что первые две являются правыми спиралями (их скрученность соответствует нарезке винтов), а последняя - левой спиралью.. Richard Wheeler / Wikipedia
В ходе дальнейших исследований оказалось, что двойная спираль ДНК, в общем-то, не обязана в точности соответствовать модели Уотсона-Крика. Физики, исследовавшие спектры препаратов ДНК, и их коллеги-кристаллографы обнаружили, что две те же самые нити можно заплести и в более толстую, более крутую спираль, которая довольно сильно отличается от модели Уотсона-Крика. Полный оборот такой спирали содержит 11, а не 10 нуклеотидов. Кроме того, их плоскости сильнее повернуты относительно оси молекулы, из-за чего в ее центре (если смотреть с «торца») образуется пустота. Да и бороздки, куда белки протягивают свои «щупальца» на поверхности такой ДНК имеют меньшую глубину.
Эта структура, в которую сворачивается ДНК при недостатке влаги, называется A-формой в противоположность классической B-форме. Этот подвид ДНК для биологов так и остался лабораторной экзотикой. Зато оказалось, что другая нуклеиновая кислота — РНК, которая тоже порой сворачивается в спираль, образует как раз именно такую структуру. То же самое происходит и с гибридами между ДНК и РНК.
В 1970-х годах удалось обнаружить еще более экзотическую структуру нуклеиновой кислоты — Z-форму. Свое название она получила от изогнутого вида линии нуклеотидов в цепях. Этих цепочек в структуре тоже две, как и в A и B-формах, но только скручены они не в правую, а в левую спираль.
В отличие от A-формы, условием образования левоспиральной Z-формы оказались не специфические условия среды, а особая последовательность нуклеотидов на ДНК. Некоторые последовательности оказались очень склонны к образованию таких форм, и соответствующие участки удалось найти в геноме многих организмов.
Richard Wheeler (Zephyris)
Z-форма ДНК
Ученым известны и другие формы ДНК: C-форма или, скажем, комплекс-тример, образующийся между тремя разными нитями во время рекомбинации. К слову сказать, именно трехспиральную структуру первоначально рассматривали Уотсон и Крик перед тем, как открыть двойную спираль. Такую же модель изучали и их конкуренты — Полинг и Кори.
Однако, пожалуй, самой необычной среди известных форм ДНК является так называемый G-квадруплекс — структура, образованная из четырех нитей нуклеиновой кислоты. Именно ее удалось в большом количестве найти на человеческих хромосомах британским биологам.
Квадруплекс
Первые намеки на возможность образования таких структур были получены задолго до прорывной работы Уотсона и Крика — еще в 1910 году. Тогда немецкий химик Ивар Банг обнаружил, что один из компонентов ДНК — гуанозиновая кислота — при высоких концентрациях образует гели, в то время как другие составные части ДНК таким свойством не обладают.
В 1962 году с помощью рентгеноструктурного метода удалось установить структуру ячейки этого геля. Она оказалась составлена из четырех остатков гуанина, связывающих друг друга по кругу и образующих характерный квадрат. В центре связь поддерживает ион магния. Такие же структуры могут образовываться и в ДНК, если в ней много гуанина. Эти плоские квадраты складываются в стопки, и получаются довольно устойчивые, плотные структуры.
В четырехспиральные комплексы могут сплетаться четыре отдельные цепочки ДНК, но это скорее является исключением. Чаще единственная нить нуклеиновой кислоты просто завязывается в узел, образуя характерные утолщения (например, на концах хромосом), либо двуцепочечная ДНК на каком-то богатом гуанином участке образует локальный квадруплекс.
Структура G-квадруплекса. Слева показан квартет гуанинов, координированный ионом магния, справа - наложение таких структур друг на друга. Стрелки показывают ход цепи ДНК.. Julian Huppert / Wikipedia
Бремя доказательства
Со всеми альтернативными, неканоническими структурами ДНК у биологов возникает одна и та же проблема. Дело в том, что получить такую ДНК в пробирке, установить ее структуру — это одно. Но доказать, что она существует в реальной живой клетке, да еще и выполняет какую-то функцию, важную для этой клетки, — это совсем другое.
С А-формой ДНК, например, до сих пор неясно — имеет ли она хоть какое-то значение для жизни или это просто лабораторный артефакт. Данных по Z-форме чуть больше: белки, стимулирующие ее образование, были найдены в некоторых вирусах.
Что касается G-квадруплекса, то это просто ярчайший пример того, как наши знания ограничиваются существующими методами. С точки зрения химии и кристаллографии о четырехспиральной ДНК известно почти все, с точки зрения биологии — очень мало. Наиболее изучено существование квадруплексов на концах хромосом - на теломерах. Также известен по крайней мере один регуляторный участок (в онкогене c-myc), в котором такая ДНК действительно существует. Но насколько такая ДНК является экзотикой, и какова ее представленность в человеческих хромосомах, до сих пор было не известно.
Теломеры — это ДНК-белковые комплексы, которые возникли у клеток с переходом от кольцевых на линейные хромосомы. При этом возникла проблема недорепликации концов: если получить полноценную копию кольцевой ДНК довольно просто, то линейная хромосома при копировании будет всегда немного укорачиваться. Компенсирует это укорачивание фермент теломераза, который достраивает концы хромосом «бессмысленными» повторяющимися последовательностями. При этом одна из цепей ДНК на конце становится длиннее другой. Именно этот одноцепочечный «хвост» и сворачивается на концах хромосом в G-квадруплексы.
Понятно, что рассмотреть структуру ДНК в микроскоп невозможно. Невозможно также применить для этого рентгеноструктурный анализ — он требует получения кристаллов и большого количества вещества. Для поиска квадруплексов какое-то время назад применялись низкомолекулярные вещества-красители, которые преимущественно связываются именно с такой структурой. К сожалению, впоследствии оказалось, что они не только связываются с четырехспиральной ДНК, но и сами стимулируют ее образование, а значит, не подходят для исследования.
Прорыв в этом направлении произошел после того, как удалось получить специфические антитела, которые связываются именно с G-квадруплексом, но при этом никак не влияют на его образование. Чтобы увидеть очень слабый сигнал от таких антител, ученые применили их на необычном объекте — инфузориях.
У этих одноклеточных имеется целых два ядра, одно из которых не используется (хранится для размножения), а во втором те же самые хромосомы тиражируются в сотнях одинаковых копий. В результате соответственно увеличивается и количество хромосомных концов, где находятся квадруплексы в составе теломер. Использование такого необычного объекта позволило рассмотреть четырехспиральную ДНК на концах хромосом, но увидеть их у человека и млекопитающих до сих пор никому не удавалось.
Инженеры антител
Именно этого добились британские исследователи из Кембриджа во главе с Шанкаром Баласумбраняном. Они создали специальные антитела, которые связываются исключительно с квадруплексом и не реагируют на двуцепочечную, одноцепочечную ДНК или на РНК. Антитела были разработаны исключительно инженерным способом — с помощью так называемого фагового дисплея, когда миллиарды и миллиарды вариантов отбираются in vitro по принципу максимальной специфичности.
Используя такие антитела на препаратах клеток, авторы увидели светящиеся точки на концах хромосом — те места, где присутствует G-квадруплекс. Еще интереснее то, что такие точки также были обнаружены и в теле хромосом — там, где их существование еще ни разу не было экспериментально продемонстрировано.
Конечно, имелись данные о наличии такой структуры в регуляторной области некоторых генов, связанных с раком. Кроме того, большое количество таких точек (более 375 тысяч) было предсказано просто по анализу последовательности генома человека. Однако такого одновременно полномасштабного и экспериментального исследования еще никому не удавалось провести.
Авторы показали, что распределение квадруплексов ДНК по геному сильно меняется в зависимости от стадии клеточного цикла. Это неудивительно и с физической точки зрения — копирование нуклеиновой кислоты без расплетения такого узла невозможно. Но сам факт, безусловно, свидетельствует о некой функциональной роли таких участков.
Хромосомы с местами локализации G-квадруплексов. Biffi, G., et al., Nature Chemistry, 2013
Впрочем, говорить о том, что мы знаем, для чего ДНК-квадруплексы важны, пока рано. Существует несколько моделей, в которых такая ДНК является регуляторным элементом, но опять-таки все упирается в вопрос, насколько справедливо переносить знания, полученные «в пробирке», на то, что реально происходит в клетке.
Сейчас основная задача молекулярных биологов — подтвердить независимым способом выводы британских ученых. Ведь методы, связанные с антителами, среди биологов известны тем, что они иногда просто отказываются работать в «чужих» руках.
Несмотря на множество грамотных контрольных экспериментов, поставленных британцами, основывать на одном исследовании слишком далеко идущие выводы о роли четырехспиральной ДНК будет довольно опрометчиво. Лучше всего было бы придумать какой-то новый, независимый от антител, оригинальный способ «поймать» G-квадруплексы на хромосомах человека. Тот, кому это удастся, возможно, и не сможет претендовать на тот самый «the Nobel prize», но место в истории науки ему обеспечено.