Шестой месяц на западе африканского континента свирепствует эпидемия лихорадки Эбола. Что представляет собой эта болезнь, какие научные наработки были сделаны в изучении заболевания и в методах борьбы с ним, каков вклад российских ученых в исследования филовирусов и почему сейчас отечественные изыскания в этой области переживают не лучшие времена, рассказывает доктор биологических наук, профессор-вирусолог Александр Чепурнов.
От города Марбург до реки Эбола
В 1967 году партия обезьян из Уганды поступила в европейские исследовательские центры Белграда, Франкфурта и Марбурга. Через некоторое время ряд исследователей, работавших с этими животными и их тканями, заболели, многие впоследствии умерли. Были зарегистрированы заболевания и у контактировавших с ними лиц. В Институте вирусологии Университета Филиппа города Марбург, памятного россиянам как место учебы Михаила Ломоносова, был изолирован возбудитель возникшей болезни, названный по имени города — вирусом Марбург. Зафиксированная в той эпидемии летальность составила 27 процентов. Важно заметить, что болезнь не отличала способность к многократной передаче от человека к человеку. Одна — максимум две передачи, причем люди, инфицированные от человека, выздоравливали. Морфология выявленного вируса была уникальна и ранее не встречалась. Это были длинные нитевидные структуры, иногда ветвящиеся, иногда завитые в виде бублика. Форма дала название новому семейству вирусов — филовирусы (от латинского filium — нить).
Вирус Марбург
Фото: Dr. Erskine Palmer, Russell Regnery, Dr. Erskine Palmer / CDC
В 1976 году одновременно в Судане и Республике Конго (тогда — Заир) произошли крупные вспышки неизвестного заболевания. Почти все заболевшие погибли. Исследование позволило выделить вирус, морфологически похожий на вирус Марбург. Выделенный возбудитель этой инфекции получил название вируса Эбола по названию небольшой реки в Заире, недалеко от деревни Ямбуку, где была отмечена эпидемия. Вспышки в Судане и Заире, несмотря на относительную близость территорий, отличались по уровню летальности.
Старший научный сотрудник Института клинической иммунологии СО РАМН, ассоциированный профессор Мичиганского университета, доктор биологических наук Александр Алексеевич Чепурнов является лауреатом премии Российской академии медицинских наук 2007 года за цикл работ по биологии лихорадки Эбола. С 1983 года он работал старшим научным сотрудником, с 1985 года — начальником лаборатории биологической безопасности, с 1989 по 2005 год — начальником лаборатории особо опасных вирусных инфекций Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор».
Фото: личный архив Александра Чепурнова
В эпидемию в Судане было вовлечено 284 человека, из них умерло 151 (53 процента), в Заире заболело 318, а умерло 280 (88 процентов). Отличия в уровне летальности и в некоторых других биологических свойствах позволило выделить два подвида: Эбола-Судан и Эбола-Заир.
Болезнь распространялась в значительной степени внутригоспитально, так как вирус Эбола передается людям при тесном контакте с кровью, выделениями и другими жидкостями организма больных людей и животных. Одна из вспышек в Габоне началась с того, что охотники подстрелили и употребили в пищу больного гамадрила. Затем заболели их родственники и односельчане, ухаживавшие за заболевшими охотниками, а также люди, участвовавшие в погребении. В Африке документально подтверждены случаи инфицирования людей в результате обращения с мертвыми или больными животными: шимпанзе, гориллами, плотоядными летучими мышами, обезьянами, лесными антилопами и дикобразами. Затем вирус Эбола распространяется в сообществах людей путем передачи от человека к человеку при тесном контакте (через нарушения кожного покрова или слизистую оболочку) с органами, кровью, выделениями или другими жидкостями организма инфицированных людей, а также при косвенном контакте со средами, загрязненными такими жидкостями. Врачи и медсестры, в том числе из европейских стран и США, работающие Африке, неоднократно погибали, заражаясь от больных.
Гамадрилы
Фото: Vincent Jannink / AFP
В 1990 году в карантине для импортированных приматов в городе Рестон (США) началась массовая гибель обезьян. Электронная микроскопия органов павших животных выявила характерные эболоподобные структуры. Первое впечатление: в центре США бушует вспышка лихорадки Эбола! Пока только среди приматов, но что дальше? Однако ход событий показал, что люди, даже близко контактировавшие с обезьянами, не заболели. У некоторых из них были обнаружены антитела к вирусу Эбола. Стало понятно, что данный вирус (получивший наименование Рестон), завезенный с приматами с Филиппин, не обладает патогенностью для человека, хотя и высоко вирулентен для приматов. На Филиппинах вирус был выделен также и от свиней, не имевших клинических признаков болезни. Среди работников, имевших контакты с обезьянами и свиньями, инфицированными вирусом Эбола Рестон, зарегистрировано несколько случаев вирусоносительства, которые протекали клинически бессимптомно.
Позднее в Африке было выявлено еще два подвида вируса Эбола: Бундибуджи (летальность — 51 процент) и Тай Форест, ранее именовавшийся Кот-д'Ивуар (единственный заболевший выжил). Подробнее перечень эпидемий Эбола можно посмотреть на ресурсе Координационного центра по инфекционным заболеваниям США. Правда, в таблице отсутствуют случаи лабораторных заражений в Гамбурге, Форт-Детрике, Сергиевом Посаде и Новосибирске.
И наконец, в 2002 году от летучих мышей в пещерах Испании был выделен эболаподобный вирус, названый позднее Лловиу. Он, так же как и Эбола Рестон, не показал случаев заражения человека. Таким образом, всего известно шесть подвидов вируса Эбола, из которых наиболее вирулентным (летальность до 90 процентов) является Эбола-Заир, виновник сегодняшней эпидемии в странах Западной Африки.
Механизмы Эбола
Механизм патогенности вируса Эбола, по-видимому, многоплановый и, несмотря на значительные исследования, не совсем понятен. Однако установлено, что он имеет несколько способов подавления иммунной защиты. Поверхностный белок вируса обладает способностью подавлять размножение лимфоцитов. Еще два структурных белка этого вируса с молекулярным весом 24 и 35 килодальтонов обладают способностью подавлять выработку организмом собственного интерферона и реагировать на введение такового. Уже в первые часы после заражения блокируется система комплемента. Кроме того, первичной мишенью вируса являются моноциты/макрофаги. Заразив клетки, призванные защищать организм, вирус распространяется в них током крови по всему организму, генерализуя инфекцию. Далее инфекция развивается либо в сторону коагуляционных нарушений, давая геморрагическую картину, либо в сторону полиорганной недостаточности в результате массивного поражения жизненно важных органов.
Нынешняя эпидемия началась в феврале 2014 года в Гвинее и далее распространилась в Либерию, Сьерра-Леоне, Мали. Сейчас стало известно о завозе вируса в Нигерию. Число жертв вспышки лихорадки Эбола в Западной Африке уже превысило тысячу человек, еще около двух тысяч заразились опасным заболеванием.
В столице Либерии — городе Монровия — безжизненное тело человека, которого местные жители считают инфицированным вирусом Эбола
Фото: Abbas Dulleh / AP
Важной особенностью данной вспышки представляется заболевание и смерть квалифицированного медицинского персонала, строго соблюдающего правила биологической защиты при работе и с пациентами, и с взятыми от них для анализов жидкостями. Это подталкивает к подозрению о возможности аэрозольной передачи инфекции. В предыдущих вспышках неоднократно отмечалось отсутствие оснований для предположений о воздушно-капельной передаче. Однако лабораторные эксперименты показывают высокую способность вируса Эбола к аэрозольному заражению: об этом можно подробнее узнать здесь и здесь. Теперь, по-видимому, необходимо позаботиться о более надежных средствах защиты органов дыхания.
Борьба с вирусом Эбола
Традиционными средствами борьбы с вирусными инфекциями являются вакцины и для экстренной профилактики — иммуноглобулины. Наиболее быстрый и традиционный метод создания вакцин — это инактивация вируса, то есть получение убитых вакцин. К таким, например, относится вакцина против клещевого энцефалита. Нарабатываются значительные количества возбудителя, очищаются от примеси посторонних белков и убиваются формалином. Прототип убитой вакцины против вируса Эбола был создан автором данной статьи в начале 1990-х годов. Исследования показали, что такой тип вакцины к Эбола не применим из-за денатурации значимых антигенных детерминант при любом способе инактивации. Однако в настоящее время разработаны и показали эффективность три прототипа рекомбинанных вакцин. Одна сконструирована на основе аденовируса, другая — на основе парамиксовируса и третья — на основе вируса везикулярного стоматита. Все три вакцины разработаны различными группами специалистов в США (впрочем, в двух последних заметное участие эмигрировавших специалистов из новосибирского Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор»). Последняя показала не только способность к профилактике, но и к экстренной профилактике, то есть, подобно вакцине против бешенства, может защищать даже после инфицирования. Вакцины пока не прошли необходимого цикла клинических испытаний, но в столь экстренной ситуации могли бы применяться в порядке исключения. Собственно, такое исключение уже было сделано при лабораторном инциденте в Гамбурге.
Другим средством противодействия вирусу в случае заражения являются иммуноглобулины. Так, активно применяются иммуноглобулины против клещевого энцефалита. Поскольку сбор сывороток крови от переболевших Эбола почти невозможен, применен метод гетерологичных препаратов. Для этого животных-доноров (козы, лошади) иммунизируют вирусом Эбола и после нескольких иммунизаций отбирают сыворотку крови и выделяют из нее иммуноглобулины. Важно отметить, что нейтрализующие иммуноглобулины удается получить лишь в случае введения значительных количеств «живого» (не «убитого») вируса Эбола. При этом Эбола-Заир вызывает болезнь только у человека и приматов. Введение значительных количеств вируса другим видам животных не вызывает болезни. Препарат эффективно применялся для профилактики лабораторных заражений.
В СССР препарат изготовлялся небольшими партиями в Новосибирске (козий) и в Сергиевом Посаде (лошадиный). Во время вспышки 1995 года партия из ста ампул лошадиного иммуноглобулина передавалась Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). Серьезным недостатком препарата является реакция пациентов на чужеродный белок, каковым является для человека лошадиный или козий иммуноглобулин. Тем не менее он многократно использовался в случае лабораторных инцидентов и предотвращал развитие болезни.
Микробиолог Синтия Голдсмит, сотрудница лаборатории Центра по контролю и профилактике заболеваний, с помощью просвечивающего электронного микроскопа воспроизвела ультраструктурную морфологию вируса Эбола
Изображение: Cynthia Goldsmith / CDC / Reuters
В США пытаются идти другим путем, разрабатывая производство биотехнологических иммуноглобулинов против Эбола. Это позволило бы избежать проблемы чужеродного белка. По-видимому, такой препарат и был применен с разрешения ВОЗ в настоящее время к трем пациентам, два из которых продемонстрировали улучшение. Однако третий умер. Этот препарат — ZMapp™ — представляет собой смесь трех моноклональных антител, то есть антител (иммуноглобулинов) против отдельных значимых фрагментов белков вируса Эбола, полученных биотехнологическим путем в растительном субстрате с техникой «очеловечивания», а именно большего сходства с человеческими иммуноглобулинами (подробнее: здесь и здесь) . Наработка препарата весьма трудоемка, но должна поддаваться масштабированию. Пока препарат, названный ZMapp™, произведен в небольшом количестве частной калифорнийской фирмой Mapp Biopharmaceutical, Inc. из Сан-Диего в сотрудничестве с LeafBio (Сан-Диего) и Defyrus Inc. (Торонто).
Следующим перспективным методом является использование малых интерферирующих РНК (siRNA). Малые интерферирующие РНК представляют собой короткие (как правило, длиной 21 нуклеотид) двухцепочечные РНК. Они могут быть искусственно введены в клетки для выключения определенного гена. Данное свойство делает короткие интерферирующие РНК удобным инструментом для исследования функций генов и изучения мишеней лекарственных средств. Но в нашем случае важнее, что уже выявлены последовательности малых интерферирующих РНК, способных блокировать экспрессию генов, необходимых для проникновения вируса Эбола в клетку или других этапов взаимодействия вирус-клетка. Этот метод активно развивают в США, где в настоящее время проходят доклинические испытания перспективных препаратов.
Современная диагностика вируса Эбола была хорошо разработана еще в 1990-е годы. В середине 2000-х была создана экспресс-тест система для безаппаратурной диагностики антигена и антител Эбола. Процедура занимает 5—10 минут и не требует никакого оборудования. Коммерчески набор не производился из-за отсутствия спроса, но необходимые компоненты доступны.
Эбола в России
В 1944 году после освобождения Крыма советскими войсками, часть солдат была привлечена к сельхоз работам, в частности уборке сена. Среди них возникло острое инфекционное заболевание, часто со смертельными исходами. В 1945 году Михаил Петрович Чумаков выделил возбудитель. Это был вирус, а вызываемая им болезнь получила название крымской геморрагической лихорадки. Позднее этот же возбудитель был выделен зарубежными исследователями во время эпидемии в Африке, в Республике Конго, и через несколько лет установлена их идентичность. Теперь болезнь носит название геморрагической лихорадки Крым-Конго.
В России и Советском Союзе наука об особо опасных инфекциях была хорошо развита. Это исторически вызвано наличием на территории еще Российской империи большого количества природных очагов чумы, туляремии, сибирской язвы. Созданная в советское время система противочумных институтов обеспечивала не только эпидемиологический контроль очагов по всей стране, но и развитие науки и средств профилактики на передовом для того времени уровне. В 1974 году было принято решение усилить внимание к развитию молекулярной биологии, и уже к концу 1980-х годов в стране появилось несколько очень сильных НИИ с достойным уровнем науки.
С вирусом Эбола также проводились успешные исследования в Белорусском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии (Минск), Иркутском научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока, Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» (под Новосибирском) и Вирусологическом центре (Сергиев Посад). Сотрудники «Вектора» первыми депонировали структуру генома вируса Эбола в банке геномов, выявили иммуносупрессивный домен в этом геноме, разработали и применяли при ряде лабораторных инцидентов гетерологичные иммуноглобулины. Многие из этих ученых, выехав на работу за рубеж, стали лидерами ведущих исследовательских коллективов. Например, Виктор Волчков первым создал систему обратной генетики для вируса Эбола и предоставил некоторые конструкции для прототипа вакцины на основе вируса везикулярного стоматита (лаборатория филовирусов Лионского университета I имени Клода Бернара, Франция). Другой ученый-выходец из России, Александр Букреев, сконструировал прототип вакцины Эбола на основе парамиксовируса (Национальная лаборатория Галвестона, США).
Коллектив лаборатории особо опасных вирусных инфекций Новосибирского вирусологического центра «Вектор» ( вторая справа — Антонина Преснякова, погибшая в результате заражения Эбола при шприцевой травме). 2004 год
Фото: личный архив Александра Чепурнова
Несмотря на отъезд ряда ведущих ученых на работу за рубеж удавалось поддерживать достойный уровень исследований. В 2000—2005 годах лаборатории особо опасных вирусных инфекций Центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» принадлежало 5 процентов научных публикаций в наиболее цитируемых журналах в этой области знания. Однако тенденция на переход НИИ данного профиля под юрисдикцию Роспотребнадзора привела сначала к прекращению исследований с филовирусами и ликвидации их коллекции в Иркутском противочумном институте, а с переходом в 2005 году в Роспотребнадзор «Вектора» одна из самых успешных в мире лабораторий, исследовавшая лихорадку Эбола, была распущена.