Ученые придумали простой способ перепрограммирования клеток, не требующий применения методов генной инженерии. Используя клетки крайней плоти новорожденных и растворы, содержащие специфичные соединения, исследователи смогли превратить их в стволовые клетки, способные трансформироваться в нейроны. «Лента.ру» рассказывает о работе американских биологов, опубликованной в журнале Stem Cells.
В ходе развития зародыша позвоночного животного формируется временный орган, называемый нервным гребнем. Его клетки (НГ-клетки) мигрируют в организме и формируют разнообразные структуры: скопления клеток периферической нервной системы, пигментные клетки кожи, хрящи лицевого черепа, часть мозговых оболочек, клетки надпочечников. Это очень интересует ученых. Чтобы изучить нервный гребень в полной мере, исследователи получают его клетки из эмбриональных стволовых клеток человека или индуцированных стволовых клеток.
Индуцированные стволовые клетки (iPS-клетки) представляют собой плюрипотентные стволовые клетки, полученные перепрограммированием клеток взрослого организма. Плюрипотентностью называют способность клетки превращаться (дифференцироваться) в клетки любых тканей, кроме внезародышевых органов (плаценты и желточного мешка). Такие стволовые клетки, находящиеся в развивающемся зародыше, называют эмбриональными (ЭСК). Дифференцировка ЭСК происходит благодаря эпигенетическим факторам — молекулам, присоединяющимся к ДНК и регулирующим ее функции. Вся совокупность прикрепленных к двойной спирали факторов образует эпигеном, и, естественно, в каждом типе тканей он разный.
Чтобы превратить клетку обратно в стволовую, нужно перепрограммировать ее эпигеном. Этого можно добиться, внедрив в нее специфические соединения, которые также влияют на активность определенных генов. Например, транскрипционные факторы Яманаки или OSKM (Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc). Как было показано, они участвуют в эпигенетической регуляции, поддерживая способность клеток к дифференцировке. Впервые их в 2006 году применил японский ученый Синъя Яманака, сумевший трансформировать фибробласты (клетки соединительной ткани, образующие межклеточное вещество) в индуцированные стволовые клетки. За это в 2012 году ему присудили Нобелевскую премию.
Эмбриональные стволовые клетки
Изображение: Nissim Benvenisty / Wikimedia
Ученые не запускают в фибробласты сами транскрипционные факторы. Вместо этого они внедряют в ДНК клеток кассету с набором генов, кодирующих OSKM. В определенных условиях, например в присутствии антибиотика доксициклина, кассета включается, и с генов начинает считываться информация для синтеза факторов.
Было показано, что внедрение генов, кодирующих транскрипционный фактор SOX10, помогает перепрограммировать фибробласты в клетки нервного гребня. Проблема в том, что для доставки генов используются вирусные векторы, чья эффективность далека от ста процентов. В результате ученым приходится идти на ухищрения, чтобы отсеять только те немногочисленные клетки, в которые удалось внедрить соответствующие гены. Более эффективный вектор усиливает риск нежелательных мутаций, способствующих формированию опухолей.
Ученые предложили альтернативу этому подходу. Вместо внедрения генов, кодирующих транскрипционные факторы, они решили найти соединения, способные заново запустить процесс образования клеток нервного гребня «в пробирке» из кератиноцитов — клеток эпителиальной ткани.
Известно, что в зародыше нервный гребень образуется из клеток, находящихся на границах нервной пластинки — зачатка центральной нервной системы. Происходит это благодаря тому, что рядом расположенные ткани выделяют определенные вещества — факторы роста, направляющие развитие клеток будущего гребня. Одно из таких веществ — фактор роста фибробластов 2 (FGF2), участвующий в заживлении ран, ангиогенезе и эмбриональном развитии. Сами НГ-клетки выделяют ряд транскрипционных факторов, играющих важную роль в обеспечении клеткам способности мигрировать.
Формирование нервного гребня
Изображение: Public Domain / Wikimedia
Используемые в эксперименте кератиноциты были выделены из крайней плоти новорожденных. Клетки культивировались в питательных средах с различными факторами роста (FGF2, WNT1, WNT, Chir99021, EGF, IGF1, BMP4, NRG1 и их комбинации), индуцирующими, как было показано ранее, развитие нервного гребня.
Кроме этого, из кератиноцитов и клеток нервного гребня выделялись матричные РНК, у которых устанавливали нуклеотидную последовательность. Это позволяло выяснить, какие именно гены активны в ДНК. Было установлено, что сочетание FGF2 и IGF1 активирует гены, характерные для НГ-клеток: SOX10, NES, PAX3, FOXD3, NGFR, и B3GAT1.
Кроме того, сформированные «в пробирке» НГ-клетки были способны дифференцироваться так, как это делают настоящие клетки нервного гребня. Они могли превратиться в нейроны периферической нервной системы, а также в шванновские клетки — вспомогательные клетки нервной ткани, поддерживающие отростки нейронов и питающие их. Кроме того, они трансформировались в меланоциты — клетки кожи, вырабатывающие пигмент меланин. Из НГ-клеток также удалось получить следующее «поколение» стволовых клеток — мезенхимальных, дифференцирующихся в остеобласты (клетки костной ткани), хондроциты (хрящевые клетки) и адипоциты (жировые клетки).
На другом этапе исследования в зародыш цыпленка были имплантированы НГ-клетки, помеченные зеленым флуоресцентным белком. Это позволяет отследить процесс миграции клеток в теле эмбриона. Клетки, как и следовало ожидать, перемещались в места, характерные для дифференцированных нейронов, шванновских и мезенхимальных клеток и меланоцитов.
Таким образом ученым удалось разработать простой способ перепрограммирования клеток без необходимости генетических манипуляций. По мнению исследователей, индуцированные клетки нервного гребня могут применяться как терапевтическое средство в области регенеративной медицины, а также как платформа для изучения нейрокристопатий — патологий, возникающих из-за дефекта развития тканей с клетками нервного гребня.