Доковырялись

Тайну «темной материи» генома разгадали с помощью CRISPR-Саs9

Изображение: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT

Молекулярные биологи из Массачусетского технологического института применили знакомую многим технологию CRISPR-Саs9 в новом для нее амплуа. Вместо редактирования генома она послужила для зондирования «темной материи» генома человека. «Лента.ру» ознакомилась с препринтом статьи, опубликованным на сайте BiorXiv, и выяснила, чем метод редактирования ДНК может помочь исследовать раковые опухоли.

Можно сказать, что вся наша ДНК состоит из двух частей. Первая — из генов, содержащих инструкции по созданию белков. Гены, как известно, это участки ДНК, в последовательности нуклеотидов которой зашифрована последовательность аминокислот, образующих белок. Информация с гена переписывается на другой молекулярный носитель — информационную РНК, и та отправляется из ядра клетки в цитоплазму, в сторону рибосом — «заводов» по производству белка. Белки осуществляют множество жизненно важных функций, поэтому можно сказать, что именно гены посредством белков формируют клетки и организм.

Большая часть вещества во Вселенной образована таинственной темной материей. Аналог темной материи есть и у ДНК. Около 98 процентов генома человека не является генами, а выполняет какие-то другие функции. Еще в 60-х годах XX века считалось, что эта ДНК вообще бесполезна, поэтому ее называли «мусорной». К ней относятся участки между генами, не кодирующие области внутри генов, которые вырезаются при формировании информационной РНК, и тандемные повторы — повторяющиеся фрагменты ДНК длиной от 1 до 100 нуклеотидов.

Однако все больше исследований показывает, что «мусорная» ДНК не такая уж и мусорная. И даже может кодировать белки, чьи функции пока неизвестны. «Темная материя» постепенно проясняется. Уже понятно, что большая часть некодирующей ДНК участвует в регуляции активности генов. Например, энхансеры, связываясь со специфическими белками — факторами транскрипции, увеличивают активность гена или группы генов. Сайленсеры, наоборот, глушат гены.

Вместе с новыми данными о некодирующей ДНК изменяются наши представления о роли мутаций в ней. Раньше считалось, что замена нуклеотидов в «мусорной» части генома никак не сказывается на клетке. Теперь известно, что мутации в регуляторных последовательностях могут вызвать серьезные сбои в работе генов, приводя, например, к раковым заболеваниям. На это указывают исследования, ориентированные на поиск связи между различными болезнями и ДНК-маркерами. Выявлено более двух тысяч различных замен одного нуклеотида на другой в некодирующей ДНК, приводящих к каким-то нарушениям в организме человека.

Как же мутации в некодирующей части генома вызывают столь серьезные заболевания? До недавнего времени ученые не располагали методами для ответа на этот вопрос. Сложность заключалась в том, что ДНК представляет собой единое целое, в котором отдельные участки могут находиться в тесной взаимосвязи. Однако сейчас молекулярные биологи обзавелись мощным инструментом — системой CRISPR-Cas9.

Напомним, CRISPR — это короткие повторяющиеся фрагменты ДНК у бактерий и архей, разделенные спейсерами — участками, отличающимися последовательностью нуклеотидов. Генетический аппарат клеток микроорганизмов позаимствовал спейсеры из чужеродных генетических элементов, принадлежащих вирусам или другим, патогенным бактериям. Фактически CRISPR — это иммунная система бактерии. Когда РНК, несущая в себе специфическую последовательность спейсера, связывается с соответствующим чужеродным генетическим элементом, тот разрушается белками Cas.

CRISPR-система может очень точно изменять геномы, вырезая из них отдельные последовательности. Ученые вносят в клетку специфический спейсер и гены, кодирующие Cas, с помощью специального носителя, именуемого вектором. Это небольшая молекула ДНК, существующая отдельно от хромосом, но также способная синтезировать РНК и соответствующие белки. Спейсер «узнает» необходимый участок, родной для клетки ДНК, и разрезает его. Так можно вносить точечные мутации, изменять отдельные фрагменты генов, генетических элементов и регуляторных последовательностей.

В новом исследовании ученые создали библиотеку CRISPR с многочисленными спейсерами, соответствующими определенным некодирующим участкам генома человека. Охватили область в 715 тысяч нуклеотидов, окружающую три различных гена. Туда вносились мутации, потенциально способные изменить регуляторную активность «мусорной» ДНК, что позволило бы выяснить ее функции. Гены, интересовавшие ученых, известны тем, что формируют лекарственную устойчивость рака кожи.

В 50-70 процентах всех случаев меланомы обнаруживается мутантная версия гена BRAF. Активность гена подавляет препарат вемурафениб, к которому почти у всех пациентов через несколько месяцев развивается невосприимчивость. Из-за выживших после воздействия лекарства клеток опухоль становится более агрессивной и быстро приводит к летальному исходу.

Чтобы выяснить, участвует ли в выработке устойчивости некодирующая ДНК, ученые построили РНК-последовательности (гидовую РНК, или sg-РНК), специфичные для участков окрестностей каждого из трех генов: 6682 sg-РНК для гена NF1 , 6934 sg-РНК NF2 и 4699 CUL3. Каждая sg-РНК содержала определенные спейсеры. В качестве вектора использовали дезактивированные ретровирусы, относящиеся к роду Lentivirus. Вирусы запустили в культуру раковых клеток и через семь дней отобрали получившие РНК-клетки, в которых Cas-белки внесли изменения в геном. После этого культуру клеток выращивали в среде с вемурафенибом в течение двух недель.

Если sg-РНК «находила» некодирующую последовательность ДНК, регулирующую активность связанного с ним гена, то белок Cas разрезал участок, нарушая правильную работу этого гена. Подобная мутация формирует устойчивость раковой клетки к действию вемурафениба. После обработки препаратом клеток меланомы с различными sg-РНК выживут только устойчивые мутанты. Если определить, что за sg-РНК в них находятся, можно понять, какие участки некодирующей ДНК участвуют в регуляции ракового гена.

Основная часть клеток вместе с sg-РНК внутри них была уничтожена лекарством. Однако исследователи нашли в выживших клетках небольшое число sg-РНК. Больше всего последовательностей приходилось на ген CUL3. Значит, в окрестностях CUL3 находилось довольно много регуляторных элементов. При этом большая часть элементов располагалась со стороны промотора — стартовой площадки, откуда начинается чтение гена для создания информационной РНК.

Регуляторные элементы могут влиять на активность гена, непосредственно взаимодействуя с его промотором. ДНК упакована в белки, что все вместе образует хроматин, который не является жесткой конструкцией и способен формировать петли. Таким образом отдаленные участки генома могут контактировать друг с другом. Кроме того, некодирующие участки ДНК, соединяясь с другими молекулами, способствуют более плотной упаковке хроматина, в результате чего гены перестают быть доступными для чтения или, наоборот, уменьшать его плотность. Обнаружилось, что в окрестностях CUL3 содержатся оба типа регуляторов.

Мутации в найденных регуляторных участках в окрестностях CUL3 провоцируют уменьшение активности гена и увеличение устойчивости клеток к вемурафенибу. В механизме, отвечающем за снижения активности, как показали ученые, задействуется ацетилирование гистонов — белков, важного компонента хроматина. Присоединение ацетильной группы к гистонам делает хроматин более открытым, а ген — доступным для фермента полимеразы, синтезирующего информационную ДНК. Однако измененный с помощью sg-РНК участок ДНК, отвечающий за ацетилирование, мешает активации гена. С помощью CRISPR-системы удалось также определить энхансеры, мутации в которых также снижают активность CUL3.

Результаты исследования продемонстрировали, что CRISPR-Cas9 — не только инструмент редактирования генома, но и мощный метод обнаружения регуляторных элементов в ДНК и выяснения их роли в развитии раковых заболеваний. В конце концов, прежде чем редактировать геном, нужно выяснить, что именно редактировать. Оказалось, что CRISPR система может и то, и другое.

Обсудить
Наука и техника00:0724 июля
Пуск ракеты «Союз-2» с Восточного

Стоп машина!

Россия откажется от «Ангары» и Восточного ради Байконура и «Союза-5»
Языческая сила
Картинка с викингом рассорила общину и довела до уголовного дела
«Кто нибудь раньше уже катался на самокате?» — «Это секретная информация»Дети дождя
Репортаж из летнего лагеря для подростков с аутизмом Центра «Антон тут рядом»
Фото: пресс-служба ресторана «Экспедиция»Фестиваль органов
Где в Москве вкусно готовят рожки да ножки
Наталья ПоклонскаяПлавающий график
Суровая рыбалка и охота за бабочками — как отдыхают депутаты и чиновники
Александр Евстифеев«Радоваться нечему. Но и ступор ни к чему»
И. о. главы Марий Эл Александр Евстифеев о том, как выжить республике-банкроту
Президент Польши Анджей Дуда с супругойСудный день
Из-за планов судебной реформы поляки перессорились между собой и с Брюсселем
Клан Хаккано
Что общего у афганской террористической группировки и героев фильма про мафию
Former Utah Gov. Jon Huntsman walks on a platform Tuesday, June 21, 2011, at Liberty State Park in Jersey City, N.J., after announcing his bid for the Republican presidential nomination, (AP Photo/Mel Evans)Многодетный мормон в Спасо-хаусе
Почему Трамп хочет назначить послом в России китаиста без знания русского языка
Древность и молодость современного Ирана
Республика через 38 лет после Исламской революции
Таиландские раболовы
Гигантские флоты с экипажами из рабов губят индонезийскую экономику
Автобус TEBНаживка для инвестора
Как технический прогресс и научные открытия рождают аферы века
Не лезь в бутылку
Помогут ли безалкогольные выходные в борьбе с пьянством
Не фондом единым
Власти решили защитить дольщиков от долгостроя
Перемена слагаемых
Как «АвтоВАЗ» планирует избавиться от лишних рук
Зато мы делаем ракеты
Почему не состоялось импортозамещение на рынке гражданского оружия
Возьмут под крыло
Для чего Росгвардии нужна собственная авиация
Похищение в особо крупном размере
Зачем неизвестные выкрали министра строительства Дагестана
Александр Шарапов и Андрей ПылевКрепкие ореховские
Убийца знаменитого киллера Саши Македонского дал признательные показания
Сверкая пятками
Как побег англичан от нацистов превратился в народный подвиг
Красная угроза
Почему в 1917 году американцев испугал пароход, полный большевиков
Пуск ракеты «Союз-2» с ВосточногоСтоп машина!
Россия откажется от «Ангары» и Восточного ради Байконура и «Союза-5»
Кто рисует машины, которые мы видим каждый день
Шеф-дизайнеры крупнейших автокомпаний, которых почти никто не знает
Заряд боди-позитива
Три причины стать владельцем электрического Smart Fortwo без крыши
Тест: угадай первые машины автодизайнеров
Знаете ли вы, с чего начинали главные автомобильные художники современности?
Величайшие машины СССР и России
10 отечественных автомобилей, которыми можно гордиться
«Я ничего не делаю, и мне это нравится»
Откровения москвички, которая сдает жилье и принципиально не работает
Зарыться в песок
Купить квартиру на море теперь можно за миллион рублей и дешевле
Входят и выходят
Самые известные, необычные и дорогие бордели мира
У вас упало
Что на самом деле происходит с ценами на квартиры в Москве