Ученые Орхусского университета (Дания) раскрыли ранее неизвестные механизмы работы системы CRISPR-Cas9, приводящие к опасным побочным эффектам. Результаты исследования, опубликованные в журнале Nature Communications, объясняют, каким образом технология редактирования генов CRISPR способствует вставкам ДНК-фрагментов в нецелевые участки генома.
CRISPR-Cas9 представляет собой генетические «ножницы», которые изначально использовались бактериями в борьбе с вирусами. Ученые применяют CRISPR в качестве нового инструмента для изменения нужной нуклеотидной последовательности ДНК. Белок Cas9 разрезает двойную цепочку на определенном участке гена-мишени. Это место определяет гидовая РНК (гРНК), которая связывается со специфическим сайтом узнавания по принципу комплементарности, указывая Cas9, где нужно произвести разрез. Если рядом находится отдельный отрезок ДНК, то он встраивается в цепочку.
В последние годы появляется все больше научных работ, демонстрирующих, что CRISPR-Cas9 индуцирует нежелательные мутации в других участках генома, некоторые из которых можно избежать с помощью традиционных методов редактирования ДНК. Несмотря на то что CRISPR широко используется в медицинских и биологических исследованиях, по этой причине она редко применяется в лечении генетических заболеваний у людей.
В новом исследовании ученые определили, почему одни последовательности гРНК действуют более точно, а другие способствует расщеплению нецелевых участков в большей степени, чем целевого. Оказалось, что на это влияет изменение свободной энергии (энергии Гиббса) связывания РНК с ДНК, и существует оптимальный диапазон изменения энергии, при которой генетические ножницы работают правильно. Иными словами, нужный участок не разрезается, если гРНК связывается с ДНК либо слишком слабо, либо слишком сильно. Наоборот, ножницы могут разрезать нецелевой участок, если изменение свободной энергии при связывании гРНК с этим участком даже при отсутствии полной комплементарности попадет в оптимум.
Вместе с этим обязательным условие для работы фермента Cas9, разрезающего нить ДНК, является присутствие мотива PAM (англ. protospacer adjacent motive или мотив, прилегающий к протоспейсеру) — короткой последовательности, которая располагается сразу после целевого фрагмента ДНК. Каноничная PAM представляет собой комбинацию нуклеотидов NGGN, где N — любой нуклеотид, а G — гуанин. При ситуации, когда имеется больше двух G подряд, комплекс Cas9-гРНК может скользить вдоль них. Когда есть несколько G до той PAM, с которой соединяется Cas9, разрезание будет более эффективно, а если есть несколько G после нее, то менее. Это объясняется тем, что скольжение приводит к появлению выпуклостей в РНК или в ДНК, влияющих на изменение свободной энергии.
Результаты работы указывают на то, что, учитывая эффекты от скольжения Cas9, можно сконструировать такую высокоспецифичную последовательность гРНК, которая оптимально связывается с целевым участком, вызывая его разрезание в большинстве случаев с малым риском нецелевых изменений. Также это расширяет возможности по внесению мутаций в те участки геномов, для которых выбор мишеней для расщепления ограничен, например, когда нужно заблокировать активность одного варианта гена и оставить активным другой вариант этого гена на соседней хромосоме.